1. 原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的孔雀石綠結(jié)晶紫和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭孔雀石綠抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物孔雀石綠結(jié)晶紫的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)孔雀石綠結(jié)晶紫的含量。
2. 試劑盒組成
（1） 酶標(biāo)板： 96 T/8孔
（2） 標(biāo)準(zhǔn)品液:（1.0 mL/瓶）0 ppb、0.05 ppb、0.15 ppb、0.45 ppb、1.35 ppb、4.05 ppb。
（3） 酶標(biāo)記物： 1瓶（12 mL）。
（4） 抗體工作液： 1瓶（7 mL）。
（5） 底物緩沖液： 1瓶（7 mL）。
（6） 底物液： 1瓶（7 mL）。
（7） 終止液： 1瓶（7 mL）。
（8） 20倍濃縮洗液：1瓶（50 mL）加蒸餾水稀釋到1000 mL。
（9） 1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品液：（0.2 mL）。
（10） 提取液A （50 mL）
（11） 提取液B （50 mL）
3. 需要但試劑盒中不提供的器材和試劑
（1）設(shè)備
…微孔板酶標(biāo)儀(450 nm)
…均質(zhì)器
…振蕩器
…離心機(jī)
…各種量程的微量移液器
（2）試劑
…蒸餾水
…環(huán)已烷
5. 儲存條件
（1） 2-8 ℃保存，切勿冷凍�！�
（2） 將不用的酶標(biāo)板放進(jìn)原袋中重新密封。
（3） 酶標(biāo)記物和顯色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
6. 樣品處理
（1） 魚/蝦樣品的準(zhǔn)備（稀釋倍數(shù)10）
先將魚肉勻質(zhì)后，稱取0.5 g樣品，加入500 μL的0.125 mol/L(Ph4.5)乙酸緩沖液，200ul的0.25g/mL鹽酸羥胺，300ul的0.05mol/L對甲苯磺酸，震蕩15分鐘使之成勻漿，12000rpm離心5min，然后取上清用PBST稀釋5倍，用作ELISA檢測
（2） 水質(zhì)樣品（稀釋倍數(shù)1）離心后取50µl作ELISA分析。
7. 免疫分析時試劑的準(zhǔn)備
（1）注意事項
A）使用之前將所有試劑平衡至室溫。
B）使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
C）在使用中不要讓微孔干燥。
D）EIA分析的重復(fù)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細(xì)按照推薦的洗板順序操作是EIA測定程序中的要點(diǎn)。
E）在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
（2）濃縮洗滌液使用前應(yīng)根據(jù)所需量進(jìn)行20倍稀釋，即按1mL濃縮洗滌液加入19mL蒸餾水的比例進(jìn)行稀釋。
8. 標(biāo)準(zhǔn)樣品配制方法：
（1）用稀釋好的洗液將1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品液稀釋1000倍，變成1000ng/mL，振蕩混勻。
（2）準(zhǔn)備5個1 mL瓶子，其中一個加入1000 μL洗液，其余的分別加入600 μL洗液。
（3）在1000 μL洗液瓶子中先吸出4.05 μL的洗液，然后加入4.05 μL的1000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品，混勻，使其濃度為4.05 ng/mL，作好記號；
（4）再從4.05ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為1.35 ng/mL，混勻，作好記號；
（5）再從1.35 ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為0.45 ng/mL，混勻，作好記號；
（6）再從0.45 ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為0.15 ng/mL，混勻，作好記號；
（7）再從0.15ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為0.05 ng/mL，混勻，作好記號。
9. 測定程序
（1）將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所需微量反應(yīng)板（均需2個平行試驗）放在反應(yīng)架上。
（2）加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)液或處理好的樣品到各自的微孔板中。
（3）加入50μl已稀釋的抗體應(yīng)用液加入微量反應(yīng)板，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，室溫下反應(yīng)20分鐘。
（4）棄去孔中液體，并將微孔板剩余殘液在吸水紙上拍干。每孔注滿稀釋好的洗液，輕輕振蕩，放置2分鐘，棄去孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復(fù)5次。
（5）加入100μl酶標(biāo)記物應(yīng)用液到微孔板中，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后， 室溫下反應(yīng)15分鐘。
（6）棄去孔中的液體，并在吸水紙上拍干，每孔注滿稀釋好的洗液，輕輕振蕩，放置2分鐘，棄去孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復(fù)5次。
（7）加底物緩沖液50μl，再加入底物液50μl，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，在室溫避光處孵育10分鐘。
（8）加入50μl終止液到微孔板中，混合好在450nm處測量吸光度值，在加入停止液后10分鐘內(nèi)讀取光度值。
10. 結(jié)果
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/mL）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠實際濃度。
11. 測定技術(shù)指標(biāo)
（1） 靈敏度：
孔雀石綠檢測試劑盒的平均檢測下限約為0.01ng/g（0.01ppb）。
（2） 準(zhǔn)確度（回收率）：回收率為90%±15%。
12. 交叉反應(yīng)活性
孔雀石綠檢測試劑盒能檢測孔雀石綠及其相似物，它們的結(jié)合程度不同。以下表格中展示的是相關(guān)值及交叉反映率（%CR），所有濃度均為ppb級。
|
種類 |
% CR |
|
孔雀石綠 |
100% |
|
隱性孔雀石綠 |
<10% |
|
結(jié)晶紫 |
100% |
|
隱性結(jié)晶紫 |
<10% |
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