1. 原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的隱性孔雀石綠隱性結晶紫和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭孔隱性雀石綠抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物隱性孔雀石綠隱性結晶紫的含量成負相關，與標準曲線比較可得出相應隱性孔雀石綠隱性結晶紫的含量。
2. 試劑盒組成
（1） 96孔酶標板：1塊。
（2） 標準品液:（1.0ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.4ppb、1.6ppb、6.4ppb、25.6ppb。
（3） 酶標記物： 1瓶（12ml）。
（4） 抗體工作液： 1瓶（7ml）。
（5） 底物緩沖液： 1瓶（7ml）。
（6） 底物液： 1瓶（7ml）。
（7） 終止液： 1瓶（7ml）。
（8） 20倍濃縮洗液：（50ml）加蒸餾水稀釋到1000ml。
（9） 提取液A
（10） 提取液B
3. 需要但試劑盒中不提供的器材和試劑
（1）設備
…微孔板酶標儀(450nm)
…均質(zhì)器
…振蕩器
…離心機
…各種量程的微量移液器
（2）試劑
…蒸餾水
…環(huán)已烷
4. 注意事項
（1）終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
（2）不要使用已過有效日期的隱性孔雀石綠檢測試劑盒；不同批次、不同試劑盒之間的試劑等內(nèi)容不可混用，以免降低靈敏度。
（3）0標準液的A450nm<0.6時，表示試劑可能變質(zhì)，請勿使用。
（4）顯色劑變藍，表明已變質(zhì)，請勿使用。
5. 儲存條件
（1） 2-8℃保存，切勿冷凍。
（2） 將不用的酶標板放進原袋中重新密封。
（3） 酶標記物和顯色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
6. 樣品處理
（1） 魚/蝦樣品的準備（稀釋倍數(shù)2）
A）魚蝦去皮取肉，用勻漿器均質(zhì)樣品；
B）稱取1.0g均質(zhì)好的樣品，放入15mL離心管中,加入0.5mL的提取液A,再加入1.5mL的提取液B，渦旋5-10分鐘；
C）3000rpm離心5分鐘，取上清，
D）取上清50μl進行實驗。
（2） 水質(zhì)樣品（稀釋倍數(shù)1）
離心后取50µl作ELISA分析。
7. 免疫分析時試劑的準備
（1） 注意事項
a) 使用之前將所有試劑平衡至室溫。
b) 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
c) 在使用中不要讓微孔干燥。
d) EIA分析的重復性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細按照推薦的洗板順序操作是EIA測定程序中的要點。
e) 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
（2）濃縮洗滌液使用前應根據(jù)所需量進行20倍稀釋，即按1ml濃縮洗滌液加入19ml蒸餾水的比例進行稀釋。
8. 測定程序
（1） 將標準品、樣品所需微量反應板（均需2個平行試驗）放在反應架上。
（2） 加入50μl的標準液或處理好的樣品到各自的微孔板中。
（3） 加入50μl已稀釋的抗體應用液加入微量反應板，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，室溫下反應30分鐘。
（4） 棄去孔中液體，并將微孔板剩余殘液在吸水紙上拍干。每孔注滿稀釋好的洗液，輕輕振蕩，放置2分鐘，棄去孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復5次。
（5） 加入100μl酶標記物應用液到微孔板中，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后， 室溫下反應20分鐘。
（6） 棄去孔中的液體，并在吸水紙上拍干，每孔注滿稀釋好的洗液，輕輕振蕩，放置2分鐘，棄去孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復5次。
（7） 加底物緩沖液50μl，再加入底物液50μl，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，在室溫避光處孵育10分鐘。
（8） 加入50μl終止液到微孔板中，混合好在450nm處測量吸光度值，在加入停止液后10分鐘內(nèi)讀取光度值。
10. 結果
以標準品百分吸光率為縱坐標，以隱性孔雀石綠標準品濃度（ng/mL）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中隱性孔雀石綠實際濃度。
11. 測定技術指標
（1） 靈敏度：
隱性孔雀石綠檢測試劑盒的平均檢測下限約為0.1ng/g（0.1ppb）。
（2） 準確度（回收率）：
回收率為90%±15%。
12. 交叉反應活性
隱性孔雀石綠檢測試劑盒能檢測隱性孔雀石綠及其相似物，它們的結合程度不同。以下表格中展示的是相關值及交叉反映率（%CR），所有濃度均為ppb級。
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種類 |
% CR |
|
隱性孔雀石綠 |
100% |
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孔雀石綠 |
〈10% |
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隱性 |
100% |
|
結晶紫 |
〈10% |
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